IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) ass en Analogon vum β-Galactosidase-Substrat, deen héich induzéierbar ass. Ënner der Induktioun vun IPTG kann den Induktor e Komplex mam Repressorprotein bilden, sou datt d'Konformatioun vum Repressorprotein geännert gëtt, sou datt et net mam Zilgen kombinéiert ka ginn, an den Zilgen effizient expriméiert gëtt. Wéi soll also d'Konzentratioun vun IPTG während dem Experiment bestëmmt ginn? Wat méi grouss, wat besser?
Loosst eis als éischt de Prinzip vun der IPTG-Induktioun verstoen: Den Laktose-Operon (Element) vun E. coli enthält dräi strukturell Genen, Z, Y an A, déi β-Galaktosidase, Permease an Acetyltransferase kodéieren. lacZ hydrolyséiert Laktose a Glukos a Galaktose oder an Allolaktose; lacY erlaabt Laktose an der Ëmwelt duerch d'Zellmembran ze kommen an an d'Zell ze kommen; lacA transferéiert d'Acetylgrupp vun Acetyl-CoA op β-Galaktosid, wat d'Ewechhuele vun den toxeschen Effekter bedeit. Zousätzlech gëtt et eng Operatiounssequenz O, eng Startsequenz P an e Reguléierungsgen I. Den I-Gencode ass e Repressorprotein, dat sech un d'Positioun O vun der Operatorsequenz binde kann, sou datt den Operon (Meta) ënnerdréckt a ausgeschalt gëtt. Et gëtt och eng Bindungsplaz fir de katabolesche Genaktivatorprotein - d'CAP-Bindungsplaz virum Initiatiounssequenz P. D'P-Sequenz, d'O-Sequenz an d'CAP-Bindungsplaz bilden zesummen d'Reguléierungsregioun vum lac-Operon. Déi kodéierend Genen vun den dräi Enzymer gi vun der selwechter Reguléierungsregioun reguléiert, fir déi koordinéiert Expressioun vu Genprodukter z'erreechen.
Wann et keng Laktose gëtt, ass den Lac-Operon (Meta) an engem Zoustand vun der Repressioun. Zu dësem Zäitpunkt bindt sech den Lac-Repressor, deen duerch d'I-Sequenz ënner der Kontroll vun der PI-Promotorsequenz expriméiert gëtt, un d'O-Sequenz, wat verhënnert, datt d'RNA-Polymerase sech un d'P-Sequenz bindt an d'Transkriptiounsinitiatioun hemmt; wann Laktose präsent ass, kann den Lac-Operon (Meta) induzéiert ginn. An dësem Operon- (Meta-) System ass den eigentlechen Induktor net d'Laktose selwer. Laktose trëtt an d'Zell an a gëtt vun der β-Galaktosidase katalyséiert, fir an Allolaktose ëmgewandelt ze ginn. Déi leschtgenannt bindt sech als Induktormolekül un d'Repressorprotein a verännert d'Proteinkonformatioun, wat zu der Dissoziatioun vum Repressorprotein vun der O-Sequenz an der Transkriptioun féiert. Isopropylthiogalactosid (IPTG) huet deeselwechten Effekt wéi Allolaktose. Et ass en ganz staarken Induktor, deen net vu Bakterien metaboliséiert gëtt a ganz stabil ass, dofir gëtt e wäit verbreet a Laboratoiren agesat.
Wéi bestëmmt een déi optimal Konzentratioun vun IPTG? Huelt E. coli als Beispill.
Den genetesch manipuléierten E. coli BL21 Stamm, deen de positiven rekombinanten pGEX (CGRP/msCT) enthält, gouf an e flëssegt LB-Medium mat 50μg·mL-1 Amp geimpelt a bei 37°C iwwer Nuecht kultivéiert. Déi uewe genannte Kultur gouf an 10 Fläsche mat 50mL frëschem LB-Flëssegt Medium mat 50μg·mL-1 Amp an engem Verhältnes vun 1:100 fir d'Expansiounskultur geimpelt, a wéi den OD600-Wäert 0,6~0,8 war, gouf IPTG an déi endgülteg Konzentratioun bäigefüügt. Et ass 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Nom Induktioun bei der selwechter Temperatur an zur selwechter Zäit gouf 1 ml vun der bakterieller Léisung dovunner geholl, an d'Bakterienzellen goufen duerch Zentrifugatioun gesammelt an enger SDS-PAGE ënnerworf, fir den Afloss vun ënnerschiddlechen IPTG-Konzentratiounen op d'Proteinexpressioun ze analyséieren, an duerno d'IPTG-Konzentratioun mat der gréisster Proteinexpressioun ze wielen.
No Experimenter huet sech erausgestallt, datt d'Konzentratioun vun IPTG net sou héich wéi méiglech ass. Dëst läit dorun, datt IPTG eng gewëssen Toxizitéit fir Bakterien huet. Eng Iwwerschreitung vun der Konzentratioun ëmbréngt och d'Zell; an am Allgemengen hoffen mir, datt wat méi löslecht Protein an der Zell expriméiert gëtt, wat besser, awer a ville Fäll, wann d'Konzentratioun vun IPTG ze héich ass, gëtt eng grouss Quantitéit un Inklusiounen geformt. Kierper, awer d'Quantitéit u lösleche Proteinen hëlt of. Dofir ass déi gëeegentst IPTG-Konzentratioun dacks net: wat méi grouss wat besser, mee wat méi niddreg d'Konzentratioun ass.
Den Zweck vun der Induktioun a Kultivatioun vu genetesch manipuléierte Stämm ass et, den Ausbezug vum Zilprotein ze erhéijen an d'Käschten ze reduzéieren. D'Expressioun vum Zilgen gëtt net nëmme vun den eegene Faktoren vum Stamm an dem Expressiounsplasmid beaflosst, mä och vun aneren externen Bedéngungen, wéi d'Konzentratioun vum Induktor, d'Induktiounstemperatur an d'Induktiounszäit. Dofir ass et am Allgemengen am beschten, ier en onbekannt Protein expriméiert a gereinegt gëtt, d'Induktiounszäit, d'Temperatur an d'IPTG-Konzentratioun ze studéieren, fir déi passend Bedéngungen ze wielen an déi bescht experimentell Resultater ze kréien.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 31. Dezember 2021